Прогрес в хормоналната диагностика на ендокринните заболявания: мас спектрометрични или имуноанализи
проф. Георги Кирилов
проф. Георги Кирилов
Лекар
Прогрес в хормоналната диагностика на ендокринните заболявания: мас спектрометрични или имуноанализи

Прогрес в хормоналната диагностика на ендокринните заболявания: мас спектрометрични или имуноанализи

Стероидните имуноанализи притежават незадоволителна специфичност, особено за ниските концентрации. За тестостерона, кортизола, естрадиола и витамин Д мас спектрометричните измервания имат решително предимство пред имунологичните и все повече се утвърждават като тяхна алтернатива.

Имуноаналитичен или мас спектрометричен  анализ за определяне на  стероидни хормони:   предимства  и недостатъци

     Ендокринологията  като клинична дисциплина винаги е била  пряко свързана с измерването на хормони in vitro.   Тя се превърна в  модерна научна област  в средата на XX век, когато след серия от открития, отличени с Нобелови премии, бяха  идентифицирани отделните хормони,  а  след 1959 г  беше въведено и тяхното имунологично  измерване – първоначално само за пептидните хормони, а от края на 60-те години и за неимуногенните стероиди. Така ендокринологията се  «въоръжи» с имуноаналитичната антитяло базирана методология, позволяваща определянето на всички видове хормони и то с такава чувствителност и специфичност, каквато беше непостижима със старите биоанализи. Още в самото начало обаче стана ясно, че анализите на стероидните хормонални субстанции трябва да се прецизират, тъй като техните структурно-молекулни особености  предпоставят кръстосана реактивност и компрометират измерването. За целта определянето им задължително се предшестваше от солветна екстракция, хроматографско пречистване за елиминиране на свързващите протеини и  използване на автентични маркирани стероиди – трудоемка лабораторна процедура, извършвана в специализирани хормонални лаборатории.  В края на 80-те години, поради нарастналата  употреба на стероидните измервания, бяха предприети стъпки за опростяване на техниките и въведени  готови реагенти (китове) за директни имуноанализи на стероиди. Обичайната практика е лабораториите да  купуват  китове (РИА, ЕЛАЙЗА, ХЛИА* и др. ), които се изработват съгласно фирмената инструкция;  за вътрешния контрол се използват готовите контроли, а  за  референтни стойности  се представят тези на производителя. Последното много често затруднява клиничната интерпретация на резултатите, още повече че  лабораториите периодично сменят  китове от различни компании, които имат различни аналитични параметри.  В научните публикации обикновено се съобщават аналитичните характеристики на производителя и по-рядко те са собствени.  По-късно анализите бяха „качени” на автоматизирани платформи,  използващи баркодиране с пряк достъп до много аналити (multiple-analyte random-access).  Тази удобна, евтина и ефективна модификация за директно измерване на стероидните хормони - без екстракционни процедури, на практика също притежава  гореспоменатите недостатъци. Подценяването и заобикалянето на  споменатите проблеми, както и обективните несъвършенства на имунонанализите,   предизвика критични  оценки и насочи вниманието към съвременните мас спектрометрични анализи (МС).  Това породи дебата:  „мас спектрометричен   или  имуноаналитичен анализ (ИА): как да се определят стероидните хормони сега и в бъдеще?”.

     Защитниците на тезата,  че  МС е най-добрият и единствено точен метод за определяне на стероидни хормони  считат,  че   тяхното навлизане като рутинен анализ трябва да става с по-бърз темп, защото МС са суперспецифични, бъдещето е на тяхна страна, а  ерата на стероидните имуноанализи постепенно трябва да приключи. Мас спектрометричните методи за измерване на стероиди съществуват от няколко десетилетия, но  едва сега се разпространиха  много по-широко. Те обаче са утвърден стандарт  за  мониториране на лекарства, в допинговия контрол, за оценка на околната среда,  за изследване безопасността на храните и др.

     Съществените вариации между ИА методите за стероидни хормони - пряка функция от епитопа на антитялото, са причина за изявена кръстосана реактивност със стероидните прекурсори, метаболити и конюгати, а също така и за матриксна интерференция  с хетерофилните  антитела при директните определяния. Тези проблеми  налагат периодично нови стандартизации,  оптимизиране на реагентите и особено на детектиращите антитела. Именно поради това ИА не предоставят трайно, сравнимо и дефинитивно химично определяне, което да е независимо от метода, така както е за измерванията на биохимичните аналити – хемоглобин, креатинин, холестерол и др.  От началото на 2015 г някои авторитетни ендокринологични списания възприеха радикален подход –  в  научните статии  стероидните измервания задължително да се извършват  по МС метод.

     Голямо предимство на МС е, че от една проба могат да се измерят десетки  различни молекули.  Съвременната течно-хроматографска тандем мас спектрометрична методология (ТХ-МС/МС) е значително опростена,  например в сравнение с газ хроматографската МС (ГХ-МС). Някои фирми предлагат китове за стероиден профил, включващ десетки стероидни мултианалити: кортизол, алдостерон, 11-деоксикортизол, 4-андростен-3,17-дион, 17-алфа-хидроксипрогестерон, кортикостерон, ДХЕА, ДХЕАС, прогестерон, тестостерон, андростендион, дихидротестостерон, естрадиол, естрон  и др. Необходимото количество серум за техния анализ е 100 μl. Компютърната обработка на анализите дава възможност за изграждане на специфичен стероиден профил (machine learning analysis).  

     Втората теза, която е по-умерена,  застъпва схващането,  че   ИА които са в употреба повече от 40 години,   все още са надеждни и  с  диагностична полза.  Изтъкват се и някои техни предимства: лесна техника, автоматизация, бързина,  по-ниска цена и масово предлагане на  търговски реагенти.  Поради това  прибързаното превключване от ИА на МС е нереалистична и ненужна задача,  защото МС са по-скъпи, по-трудоемки и по-непроизводителни,  изискват специална апаратура и все още липсва широко търговско предлагане,  както е за имуноаналитичните китове.

 

Принципи на мас спектрометрията и клиничното й приложение

     МС е  най-модерният и съвременен метод,  базиран на  фрагментиране на измерваните молекули, разделяне и измерване на  отношението маса/тегло на компонентите.  При комбиниране с течна хроматография (ТХ), мас спектрометърът функционира като уникален детектор,  предоставящ информация за структурата и състава на съединенията. Вътрешните  стандарти, аналогични на  измерваните молекули, гарантират прецизността на  определяния аналит. Една от разновидностите  на МС е тандем мас спектрометрията, която включва  два анализатора, разделени с апарат за йонна активация.  Първият анализатор изолира и дисоциира йоните чрез активирането им,  а вторият е за анализ на дисоциираните продукти, което позволява  дефинитивно измерване  на множество ендокринни аналити.  ТХ-МС/МС  е идеалният вариант за едновременен количествен анализ на стероидни  хормони.   Цялостният анализ включва три фази: (1) подготовка на пробата, (2) хроматографско разделяне (ако е необходимо) и  (3)  МС анализ.

    ТХ-MС/MС измерването  също подлежи на автоматизация или полуавтоматизация,  без да е необходима дериватизация на стероидите, например за повечето Δ4-стероиди. Модерните тройни, четири цилиндрови инструменти (triple quadrupole instruments) отговарят на изискванията за измерване на ниски концентрации на стероиди в малък обем от пробата. На този етап рутинното въвеждане на ТХ-MС/MС се затруднява от два основни  фактора -  цената на мас спектрометричната апаратура е висока (~400 000 € ) и  е необходима специализирана квалификация на персонала.  Като цяло инструментариумът е усложнен, скъп и капризен за поддържане. Друга важна причина за по-инертното навлизане на МС методологията е, че някои изследователски центрове имат опасения, че резултатите от МС, макар по-надеждни и прецизни от ИА,  ще бъдат трудно сравними със старите данни, особено при продължаващите изследователски проекти.

     МС спестява средства обаче,  ако едновременно се определят няколко аналита. Пресмята се, че за комплект от 6 стероиди: кортизол, андростендион, ДХЕАС, тестостерон, 17- хидроксипрогестерон и прогестерон,   с ТХ-МС/МС  цената на единичното изследване  е няколко пъти по-ниска като се прави само един анализ, докато за имунологичното им определяне са необходими 6 различни кита и 6 анализа. 

     В клиничната практика ТХ-МС/МС е предпочитана техника за определяне на стероидни хормони при интегрална оценка на стероидогенезата,  за  диференциране  на  метаболитните  заболяванията  от  тези с нарушения  в  стероидния биосинтез,   за дефиниране на нови метаболоми на биосинтетичните и метаболитни нарушения,   в педиатрията -  поради по-малката им  инвазивност  и за пренатална диагностика на нарушенията в стероидния биосинтез.  ТХ-МС/МС  е идеалният метод за скрининг у новородени.

     Чрез детайлното изследване на стероидния профил  се установи, че някои надбъбречни инциденталоми, смятани за  хормонално-неактивни,   продуцират повишени количества стероидни прекурсори и всъщност са  хормонално активни. Увеличена екскреция на прекурсорите - прегнендиол, прегнентриол, ДХЕА, 16α-OH-ДХЕА и прекурсорите на активните андрогени - андростерон  и  етиохоланолон се открива  в  70%  от случаите с надбъбречен карцином, докато при аденом  само в 2%.  Малигнените  надбъречните тумори изявяват  характерен дисбаланс в стероидогенезата -  повишава се  съотношението  ранни стероидни прекурсори/крайни стероидни хормони. Това корелира с  незрелостта на стероидната биосинтеза и недиференцираността  на тумора.  Следователно, измерването на уринния стероиден метаболомикс** е биомаркер за функционалната активност на надбъбречните инциденталоми  и  за малигненост  на надбъречните тумори.   Например,  установяването на повишена продукция на  11-деоксикортизол и тетрахидро-11-деоксикортизол има висока дискриминативна стойност за разграничаване на  надбъбречния карцином от доброкачествения аденом.

     Вече се изтъкна, че съвременните имунологични изследвания (РИА, ЕЛАЙЗА, хемилуминисцентни и др.) на стероидните хормони, които най-често се назначават в ендокринологичната практика -  тестостерон, естрадиол и  кортизол,  както и витамин Д,  са проблематични  и това рефлектира върху диагностичната надеждност на резултатите.  Ще  представим   някои конкретни примери, илюстриращи  тези проблеми.

 

Тестостерон

     Сравнителната оценка на резултатите от измерване на тестостерона с  ИА и съпоставянето им  с МС  показва, че  директното определяне с комерсиални имуноаналитични китове е особено неточно за ниските стойности -  каквито са у  деца, жени и  при мъжете с тестостеронов дефицит.  Референтните граници на имунореактивния тестостерон при мъже са силно вариабилни в долния диапазон, което затруднява преценката на андрогенния статус и води до несравнимост на резултатите.   Изследвания  проведени с  10 кита за  измерване на тестостерон  - 8 автоматизирани имунонанализатори: Architect i2000 (Abbott Laboratories), ACS-180, Immuno-1 (Bayer Diagnostics), Vidas (Bio-Mérieux), Immulite 2000 (Diagnostics Products Corp.), Vitros Eci (Ortho Clinical Diagnostics), AutoDelfia (Perkin-Elmer), Elecsys 2010 (Roche-Boehringer-Mannheim) и 2 РИА метода: Immunotech (Beckman-Coulter) и Coat-A-Count DPC (Dade Behring)  разкриват , че  референтните граници на тези методи  показват много съществени вариации, както в областта на долния  (от 6 до 12 nmol/l ),  така и на горния диапазон ( от 27 до 60 nmol/l).

     Андрогенните стероиди (ДХЕАС, дихидротестостерон), които имат много близка структура до тази на тестостерона интерферират при измерването му, с което се отчитат неточни резултати.  Тестостеронът, измерен  чрез МС е сигнификантно по-нисък, а в долния диапазон показва незадоволителна корелация с имунореактивния тестостерон.  Така наречените „дериватни  измервания на тестостерона”  (свободни и бионалични)  – например, калкулиран свободен тестостерон,  са на базата на изчисления,  а не на действително определяне, което може да се извърши само чрез МС.

     Определянето  на стероидния андрогенен метаболомикс чрез ТХ/МС-МС  разкрива много по-детайлно  картината на  андрогенните нарушения  при жени и допринася за прецизиране диагностиката на хирзутичните състояния,  включително   и  при синдрома на поликистозни яйчници.

 

Естрадиол

     Диагностичното приложение на естрадиола при жени е твърде широко и включва:  преценка на овариалната функция, на менструалните нарушения,  на преждевременния и забавен пубертет и при асистираните репродуктивни протоколи.  При мъже естрадиолът има диагностична стойност  при гинекомастията, преждевременния пубертет и др.  Споменатите аналитични проблеми при тестостерона важат с още по-голяма сила за   измерването на  серумните нива на естрадиола,  които са в пикомоларни стойности – 10 до 100 пъти по-ниски от тези на тестостерона.  Съпоставката  на различни имунологични методи разкрива големи вариации в резултатите, което се дължи  на различия в детектиращите антитела, матриксна интерференция и несъвършена  стандартизация (фиг.1).

 

 

 

Фиг.1. Серумна концентрация на естрадиола  измерен  в 101 серума от здрави мъже ( >40 год)   с ТХ-MС/MС  и с  5  търговски имуноанализи (A- Siemens ADVIA, B- Siemens IMMULITE 2000, C- Abbott ARCHITECT, D- Roche cobas и E-Beckman Coulter Access). Пунктираните линии представят  95% доверителните граници на  ТХ-MС/MС  ( по Handelsman, D et al. )

 

     Директният  имуноанализ  на естрадиола при деца, мъже и при жените в менопауза, както и при лечението  с ароматазни инхибитори,  където стойностите му са значително по-ниски,  е неточен и неподходящ за целите на научните проучвания.  Съобщава се, че нито един от автоматизираните мултианалитни методи не  притежава функционална чувствителност, достатъчна за точното измерване на естрадиола при мъже.  Антитяло базираните методи са с долна граница на определяне >10  pg/ml (37 pmol/l) и те са недостатъчно прецизни при концентрации  200–250 pmol/L.  Именно поради това е в ход заместването им от МС анализи, за които е свойствена в пъти по-висока чувствителност - 1 pg/ml (3.7 pmol/l).  Вече са създадени референтни интервали за стероидни хормони по ТХ-MС/MС.

 

 Кортизол

     За практически цели  са въведени рутинни и бързи ТХ-МС/МС анализи на кортизол с едновременно измерване и на преднизон, преднизолон и кортизон, което решава  проблема с кръстосаната реактивност - характерна за РИА  и   платформените ИА на кортизола при пациенти приемащи екзогенни стероиди.  Чрез този подход се избягва погрешното диагностициране – измереният кортизол чрез ИА може да е фалшиво повишен, вследствие интерференцията с горните глюкокортикостероиди,  докато в действителност пациентът да е с хипоадренализъм.

     Проблемите с различията в праговите стойности на имунореактивния слюнчен кортизол, чието измерване има висока стойност в диагностиката на  хиперкортизолизма, се преодоляват чрез мас спектрометричното му определяне,  елиминиращо  интерференцията с хидрокортизона.    Много проучвания сочат, че слюнченото  МС измерване на кортизона  се очертава като по-добър маркер от кортизола. Количественото определяне на кортизол и други стероиди в косми от скалпа също е многообещаващ  диагностичен подход в ендокринологията.

 

Алдостерон и минералокортикоиди

     При първичния алдостеронизъм (ПА) свръхсекрецията  на алдостерон се съпътства с повишена продукция на други минералокортикоиди и това е регистрирано както  на периферно и уринно ниво, а също така и в туморната тъкан и в надбъбречната венозна плазма.  Данните от  МС анализа изясниха, че 18-хидроксилираните хибридни стероиди – 18-оксокортизол и 18-хидроксикортизол доминират при алдостерономите, в сравнение с билатералната хеперплазия. По този начин може да се направи точна преценка на различията в стероидния профил при двата патогенетични фенотипа на ПА  и те да се подтипизират. Измерването на минералокортикоидния метаболомикс разкрива връзката между специфичната експресия на стероидогенните ензими, респ. съпътстващите ги соматични мутации, и подтипа на ПА.

 

Витамин Д

     Витамин Д  спада към трудните за измерване аналити.  Само ТХ-МС/МС методите могат да дадат  количествена оценка на съединенията на витамин Д чрез мултиметаболитен анализ.    Възприето е, че за клинични цели трябва да се определя общия 25(OH)Д, включващ   25(OH)Д3 и 25(OH)Д2.  Някои  имунологични анализи за общ 25(OH)Д показват съществена кръстосана реактивност с 25(OH)Д2  и това може да се окаже проблем, тъй като суплементацията с витамин Д2 е широко разпространена. Интерференцията  с метаболити като  24,25(OH)2Д, който обичайно е < 12 nmol/l,  повлиява капацитета на витамин Д свързващия протеин и променя резултата.   Освен това преобладаващите имунонализи за 25(OH)Д са с ниска чувствителност при концентрации < 20 nmol/l. Платформеният имунонанализ на общия 25-OHД е по-евтин и по-бърз и на този етап  това е съществена причина ТХ–MС/MС - най-добрият метод за определяне на витамин Д,  да има ограничено разпространение за клинични цели.

 

Заключителни бележки

     Много експерти считат, че наближава краят на ерата на имуноаналитичните методи за измерване на стероиди и някои други хормонални аналити. Ендокринната диагностика ще  трябва да се „превъоръжи” с въвеждането на мас спектрометричната методология, която има безспорни предимства пред антитяло базирания анализ.  Ползата ще бъде безспорна -  много по-голяма точност и  сравнимост на резултатите,  стандартизация на хормоналните изследвания и детайлна  преценка на стероидния метаболомикс. Това ще предизвика съществена промяна в представите ни както по отношение на ендокринната физиология, така и за патогенезата на някои ендокринни заболявания.  

     Дали процесът на „превкючване” от ИА към МС като стратегическа технология ще се осъществи бързо и ще навлязат ли последните по-широко в клиничните и  ендокринни лаборатории, ще зависи от технологичното усъвършенстване на апаратурата за МС,  пригодността й за рутинна диагностика и финансовите разходи за изследванията.  В  развитите страни МС технологията намира приложение  в 15% от клиничните лаборатории,  чиито профил е предимно изследователски. На този етап най-разпространените МС анализи, използвани за рутинни цели в клиничните лаборатории, са тези за определяне на витамин Д,  на андрогени и естрогени, за скрининг у новородени и за мониториране на имуносупресори.

     За други хормонални параметри - най-вече тиреоидни хормони, тиреоглобулин и някои пептидни хормони  (инсулин),  МС също е с  предимства пред  ИА, но тяхното практическо въвеждане се очертава на по-късен етап.  Свободните плазмени метанефрини са друг пример за важно рутинно ТХ-МС/МС изследване в диагностиката на катехоламин-секретиращите феохромоцитоми и параганглиоми.

 

* РИА - радиоимунологичен анализ, ЕЛАЙЗА – ензимно-имунологичен анализ, ХЛИА – хемилуминисцентен имунонанализ

** стероиден метаболомикс  -  едновременното и пълно определяне на  нивата на стероидните хормони  в метаболома и промените им  под влияние на различни стимули.

 

Библиография

1. Kirilov G.  Hormonal and functional diagnostics of endocrine diseases.  Paradigma (ed.), 2012 (in bulgarian).

2. Adaway JE, Keevil BG and LJ Owen. Liquid chromatography tandem mass spectrometry in the clinical laboratory. Ann Clin Biochem. 2015;52:18-38.

3. Arlt W, Biehl M, Taylor A et al. Urine steroid metabolomics as a biomarker tool for detecting malignancy in adrenal tumors. J Clin Endocrinol Metab. 2011; 96: 3775–3784.

4. Di Dalmazi G, Fanelli F, Mezzullo M  еt al. Steroid Profiling by LC-MS/MS in Nonsecreting and Subclinical Cortisol-Secreting Adrenocortical Adenomas. J Clin Endocrinol Metab. 2015;100:3529-3538.

5. Farrell CJ, Martin S, McWhinney B et al. State-of-the-art vitamin D assays: a comparison of automated immunoassays with liquid chromatography–tandem mass spectrometry methods.  Clinical Chemistry. 2012; 58: 531–543.

6. Handelsman, D et al.  Performance of direct estradiol immunoassays with human male serum samples. Clin Chem 60 .2014  510-517.   

7. Handelsman DJ and  L Wartofsky. Requirement for mass spectrometry sex steroid assays in the journal of clinical endocrinology and metabolism. J Clin Endocrinol Metab. 2013; 98: 3971–3973.

8.  Hershel R and RJ Singh. Measurement of late-night salivary cortisol and cortisone by LC–MS/MS to assess preanalytical sample contamination with topical hydrocortisone. Clin Chem. 2012; 58: 947–948.

9. Hoofnagle AN and MH Wener. The fundamental flaws of immunoassay and potential solutions using tandem mass spectrometry. J Immunol Met.  2009; 347: 3–11.

10. Huhtaniemi IT, Tajar A, Lee DM et al. Comparison of serum testosterone and estradiol measurements in 3174 European men using platform immunoassay and mass spectrometry; relevance for the diagnostics in aging men. Eur J Endocrinol.  2012; 166: 983–991. 

11. Ketha H, Girtman A and RJ Singh. Estradiol assays--The path ahead. Steroids. 2015;99 (Pt A):39-44.

12. Moors M, Williams T, Deinum J et al. Steroid Hormone Production in Patients with Aldosterone Producing Adenomas. Horm Metab Res. 2015; 47: 967-972.

13.Müller MJ and DA Volmer.  Mass spectrometric profiling of vitamin D metabolites beyond 25-hydroxyvitamin D. Clin Chem. 2015;61:1033-48.

14. Noppe G, de Rijke YB, Dorst K et al. LC-MS/MS-based method for long-term steroid profiling in human scalp hair. Clin Endocrinol (Oxf). 2015;83:162-166.

15. Owen LJ, Wu FC and  BG Keevil. A rapid direct assay for the routine measurement of oestradiol and oestrone by liquid chromatography– tandem mass spectrometry without derivatisation. Ann Clin Biochem. 2014; 51: 360–367.

16. Peitzsch M,  Dekkers T, Haase M et al. An LC-MS/MS method for steroid profiling during adrenal venous sampling for investigation of primary aldosteronism. J Steroid Biochem Mol Biol.  2015; 14: 75–84.

17. Rosner W, Auchus RJ, Azziz R et al.  Position statement: utility, limitations, and pitfalls in measuring testosterone: an Endocrine Society position statement. J Clin Endocrinol Metab. 2007; 92: 405–413. 

18. Rosner W, Hankinson SE, Sluss PM et al.  Challenges to the measurement of estradiol: an Endocrine Society position statement. J Clin Endocrinol Metab.  2013; 98: 1376–1387.  

19. Rothman MS,  Carlson NE,  Xu M et al.  Reexamination of testosterone, dihydrotestosterone, estradiol and estrone levels across the menstrual cycle and in postmenopausal women measured by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Steroids.  2011; 76: 177–182. 

20. Shackleton C.  Clinical steroid mass spectrometry: a 45-year history culminating in HPLC-MS/MS becoming an essential tool for patient diagnosis. J Steroid Biochem Mol Biol. 2010; 121: 481–490. 

21. Strathmann F and N Hoofnagle.   Current and Future Applications of Mass Spectrometry to the Clinical Laboratory. Am J Clin Pathol.  2011; 136: 609-616.

22. Taieb J, Mathian B, Millot F et al. Testosterone measured by 10 immunoassays and by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry in sera from 116 men, women, and children. Clin Chem. 2003; 349: 1381–1395. 

23. Taylor A, Keevil B and I Huhtaniemi.  Mass spectrometry and immunoassay: how to measure steroid hormones today and tomorrow. Eur J Endocrinol. 2015; 173: D1–D12.

24. Turpeinen U and E Hämäläinen.  Determination of cortisol in serum, saliva and urine. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2013;27:795-801.

25. Vesper HW, Botelho JC, Vidal ML et al. High variability in serum estradiol measurements in men and women. Steroids. 2014; 82: 7–13.

26. Wang C, Catlin DH, Demers LM et al.  Measurement of total serum testosterone in adult men: comparison of current laboratory methods versus liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Clin Endocrinol Metab. 2004; 89: 534–543. 

27. Wester VL and van EF Rossum. Clinical applications of cortisol measurements in hair. Eur J Endocrinol. 2015;173:M1-10.

Реклама

Мнения