Този  преглед включва информация за MALDI- TOF  MS - този  нов  и  уникален  метод, който  се  прилага  в  съвременните  лаборатории по  целия  свят и  неговата  голяма  значимост  за  клиничната  практика.

Диагностичното  търсене  включва  разсъждения   и  анализи от  физикалния преглед и  допълнителните  изследвания. Тъй като  патогенезата  и  фенотипът на  различните  заболявания варират, а  също  така  и  диагностичните  модели  се  променят, се  търсят  все  нови  и  нови  диагностични  възможности  в  тази  насока.

1.      Вътрешният  преглед - лекарите  обикновено  започват с  търсене  на  видими  аномалии с  помощта на  богатите  си   знания и пропедевтични  умения, като  уголемени органи или  промени  в  общия физикален  статус, които  могат  да   показват  наличието  на  заболяване. Това е  бързо  ориентиране  в  ситуацията, но  не  е  достатъчно за  точна  диагноза.  Пристъпваме  към  лабораторните  тестове на  второ  ниво.

2.      За  лабораторните  тестове обикновено  се  събират и  изследват  проби  от  всякакъв  биологичен  материал /кръв,секрети,урина и др/, но  често се  сблъскваме с трудности по  отношение  на  взетото  количество субстрат, което е  недостатъчно  за  изследване. Лабораторната  медицина /ЛМ/ винаги  е  заемала много  важно  място  в  диагностичния процес.

3.      На  трето  ниво  пристъпваме  към образната  диагностика, която  позволява на  лекарите  да  изследват  вътрешните  органи по неинвазивен  начин чрез   компютърна  томография /CT/, ядрено-магнитен резонанс /MRI/, позитронно-емисионна томография/PET/  , ултразвук и  Ро  изследване.

4.      На четвърто  ниво  се  пристъпва в случаи,  при  които биопсията е  единственият начин за  окончателно диагностициране на  злокачествено  заболяване и  други  органни  промени. Тази  диагностика  е  инвазивна и понякога доста  закъсняла във времето.

Предвид  дългият  цикъл, късният ход  на  заболяването, ниската  чувствителност и  силната  инвазивност  на  много  клинични, диагностични  методи, както и  сложността на  възникването и развитието на  самите  заболявания, се е  появила  нуждата от  разработване на  нови  методи за  откриване на  заболявания, още  в  най-ранния, функционален стадий на  ниво  клетка,  тъкан  и органи, за да  се  помогне на  лекарите  да  вземат правилни  медицински  решения.

Точно  тук  идва  на  помощ тази  уникална нова  технология: MALDI - TOF  MS

В  десетилетието  след  присъждане  на Нобеловата  награда за  химия през  2002г., матрично-асистираната лазерна, десорбционна/йонизираща  време-полетна масспектрометрия/ MALDI- TOF  MS  / се  използва  широко  като  инструмент в аналитичната химия  за  откриване   на  големи  и  малки  молекули - протеини, пептиди, нуклеинови  киселини, аминокиселини, липиди и т. н.

Проф. Коичи Танака е японски химик , лауреат на Нобелова награда за химия (2002). 

Мотивация за наградата на тримата Джон Б.Фен,Курт Вютрих и Коичи  Танака: „за тяхното разработване на йонизационни методи за мека десорбция за масспектрометрични анализи на биологични макромолекули“.

Тази методика  се  използва и за  клинични  анализи  и  изследвания: например идентификация  на  патогени, скрининг  на  генетични заболявания, диагностика  на  рака, невро-дегенеративни  заболявания и т. н.

Преди  2012г. се  подчертава развитието  на  MALDI- TOF  MS   в "анализа  на  нуклеинови  киселини", но  през  следващите  години фокусът е  изместен към  диагностиката  на  заболявания.

От 2011г. до 2021г. темите "диагностика  на  заболявания" и " анализ  на  малки  молекули" се  развиват  интензивно.

От 2015г. " идентифицирането  на  патогени" е най-  фокусираната  тема с  много  публикации.

Или  четирите най-важни теми  на  MALDI- TOF  MS    в   клиничните  приложения  могат  да  се  обобщят така:

·        идентификация на  патогени

·        диагностика  на  заболявания

·        анализ  на  нуклеинови  киселини

·        анализ  на  малки  молекули

Какво  представлява  тази  нова технология MALDI- TOF  MS ?

Това е  аналитична  техника, която  измерва съотношението маса/заряд на  йоните, образувани, когато  молекула или  атом се  йонизират, изпаряват и  въвеждат  във  вакуум.

Масспектрометрията / MS  / може  също  така  да  включва разбиване на  молекули на фрагменти, като  по  този  начин  позволява  да  се  определи  тяхната  структура.

M A L D I =   M-Matrix , A- Assisted,  L-Laser, D-Desorption, I-Ionization,  TOF- време  на  полет

Тази  нова  методика е пример как новите  технологии могат  да  са  много  полезни за  хората, ако  се  използват по  посока  запазване на  здравето, превенция , поставяне  на  ранна  диагностика, когато  началото  е  свързано с нарушена  клетъчна функция, а  това  предполага навременно и  ефективно  лечение.

Лабораторната  медицина /ЛМ/ винаги  е  заемала важно  място в диагностичния процес на лекарите. Тя  обединява  всички  медицински  специалности и профили, като  в  това  се  състои  нейната  уникалност. Тя  непрекъснато  се  обогатява и усъвършенства и  по  този  начин дава  възможност новите  технологии и открития,  натрупани  знания във  фундаменталната  наука, да  навлязат и  в клиничната  практика  на лекарите. ЛМ  обхваща  целия  лечебен, диагностичен и профилактичен  процес, свързан   с  пациента/човека в  здраве  и  болест. Тук  можем  да  посочим  голямото  значение, което  тя  има  при  персонализираната  медицина, първичната  профилактика, функционалната  медицина, ранното  откриване  на  генетични  заболявания и много др./,  като  изследване на  храни, лекарства и изготвяне на план-профилактика на  храни, според гените  на  всеки  човек,  например/.

ЛМ е  типичен  пример   за   интегралния  принцип, обединяващ всички  профили и лекари  в медицината...

Предимства  на  MALDI- TOF  MS:

1.      Малък  обем  от анализирания биологичен  субстрат-  работи  се  с наночастици, като  се  избягват  всички  трудности при  взимането  на  пробите от биологичен  материал.

2.      За  кратко  време  се  изработват  стотици проби  в  един  работен  цикъл, с  голям обем от база  данни.

3.      Абсолютна  специфичност !

4.      Недостижима  чувствителност!

5.      Уникална  бързина по  отношение  на  резултатите от 1 мин.  до  максимум  няколко  часа,  ако се  касае  за  генетични  изследвания

6.      Стъпката  на  извличане на  признаци, може  да  се  разглежда като  "откриване на  биомаркер" на  заболяването.

7.      С  избраните  биомаркери може  да  се  създаде модел за  диагностициране на  заболяването въз  основа  на  специфични  методи  за  машинно обучение.

8.      Установеният модел може  да  бъде  оценен сред  тестови  проби по  отношение на  прецизност, точност, чувствителност, специфичност и площ  под  кривата  на  работната  характеристика на  приемника /AUC/.

Клинично  приложение  на MALDI- TOF  MS

Изследванията  Биомолекулярна MS  и  Протеомика  се  фокусират върху  използването  на MS  за  разбиране на  вътрешната  работа  на  всяка  клетка  в  човешкия организъм. MS  дава  възможност за  характеризиране  не  само  на  молекулите, които  присъстват  в  клетките, но и  позволява  идентифицирането и характеризирането  на  протеини и други  биомолекули, които  работят  заедно и участват  в  клетъчните процеси в здраве и болест. MS  натрупа  голям  световноизвестен  опит в анализа на  протеин-лиганд, протеин-протеин и протеин- ДНК анализ.

Търсенето  на  специфични  биомаркери за  заболяване е  било трудна  работа през  цялото  време. Това е много ценна  информация в  ранния, предклиничен  стадий на болестта. Стадият  на  функционалните  нарушения на  ниво  клетка и нарушения в  нейната  физиология.Точно  тук  идва  на  помощ MALDI- TOF  MS.

Техниките  OMICS  придобиха голямо  значение в  био- аналитичните области през  последните  години.  "Омика" са  науки,  които  са  важна   част  от  системната  биология  и  са  от  голямо  значение  за  съвременната  био медицина.       

Тук спадат: геномика, митогеномика, транскриптомика, интерактомика, гликомика, липидомика, микробиомика, нутригеномика, епигеномика и други - "омика". Понякога  дори  се  използва  терминът "мултиомични изследвания".  Въпреки  че  списъкът е  голям, ще  се  спра само  на  някои  от  тях.

Протеомика

Това е изучаването  на протеиновия  състав на клетките, тъканите и организмите.

Докато човешкият  геном има малко  над  20 000 гена, то  човешкият  протеом съдържа над  един  милион различни  по  форма  протеини. Този  сложен и  динамичен  свят  на  клетъчните  протеини, може  да  се  изследва с  помощта на  MS. Протеините  имат  различна  класификация, но една е особено  важна:

·        housekeeping proteins/ поддържащи  къщата  протеини - буквален превод/ към тази  група  протеини  спадат: ензими, транскрипционни  фактори,необходими  за  синтез на  нуклеинови  киселини и  структурни протеини. Такива  протеини  имат  всички  клетки в организма, но  "луксозните  протеини " са  по- особени.

·        luxury proteins- това  са   клетъчно- специфични протеини, които  са  специфични  само  за  определен  клетъчен  вид, затова  се  наричат  така "луксозни". Точно  тези  протеини са  клетъчните  маркери или  клетъчни белези.

Примери от ендокринологията  за "luxury proteins"  или  клетъчни  маркери

UCP-1= Uncoupling protein-1  е биомаркер за  адипоцити, произлизащи от кафявата  мастна  тъкан. Той се  намира  от вътрешната  митохондриална мембрана и представлява " подписът" на КАТ / кафявата  мастна  тъкан/. Този  протеин  "разделя", пренасочва, потока на  протони /Н+/ не  към  хидролизата  на  АТФ в окислителното  фосфорилиране, а към  получаване  на  топлина- или  това  е  процесът  на   термогенеза, затова  този  протеин е известен и като  "термогенин". КАТ е термогенен  орган. А биомаркерът на  този  термогенен  орган  е: UCP-1, заедно с още  два протеина -UCP-2, UCP-3. Тези  три  протеина са  усилено  проучвани и изследвани  през  последните  години , тъй като  тяхното  активиране  би  могло  да  доведе  до  редукция на  теглото.

Друг  пример  са  невропептидите NPY, VIP, CGRP, Kisspeptide.  Това  са  биомаркери за  нервните  клетки и клетките  на  дифузната  невроендокринна  система /ДНЕС/.

Тиреоглобулина е специфичен  маркер за  ЩЖ, С-peptid е маркер  за  функцията на  бета клетката на  ендокринния панкреас и т.н.

Протеините  биват още  структурни  и регулаторни, като  клетъчните  протеини  имат  три  основни  свойства: 1. морфогенни/структурни/ свойства; 2.регулаторни  свойства- тези  протеини  регулират и контролират  клетъчните  процеси; 3. ензимни  свойства- това  са  протеини,  които  катализират  реакциите ензим/субстрат.

Протеомиката  е  много  ценна  с  това, че може  да  установи  и  даде   богата  протеинна  информация в  ранния,  пред клиничен  стадий на  болестта. Стадият  на  функционалните  нарушения, които  са  на  ниво  клетка и нарушения в нейната  физиология.

Пример: екзозомите са  наномащабни  клетъчни  везикули, които  обхващат вътреклетъчни  вещества като  липиди, метаболити, протеини, генетични  материали и ги  изнасят  в екстрацелуларното пространство. Секретирани от всички  видове  човешки  клетки и циркулиращи  с кръвта, екзозомите са  свързани  с  много  физиологични и  патологични  процеси   в  клетките.  MALDI- TOF  MS  позволява  тяхното точно  измерване, а  заедно  с  това  и измерване  на  други ендогенни  биомолекули в  голям  мащаб с висока  производителност и  точност за  по- малко  от една  минута  време. Тази  възможност за  ранно  верифициране  на  промените от  този  порядък  са  с  особена  важност   за раковата  биология.

Чрез  анализиране на  протеинови  промени  в  различни  етапи от  началото  на  дадено  заболяване, протеиновите  биомаркери могат  да  бъдат идентифицирани  в  различни  периоди от заболяването, което  е  важно  не  само  за  диагнозата  и откриване  на  заболяването  в  много  ранен стадий, но  също  така  служи като  цел  за  скрининг на  лекарства и насоки  за   тяхното  приложение  при тези  случаи.

Метаболомика

Метаболомиката  е изследвания на химичните  процеси на  клетъчно  ниво, включващи  метаболити от различни  химични  реакции. Така  нареченият  "метаболом" представлява  съвкупността от  всички  метаболити, които са крайни  продукти на  клетъчни  процеси, в биологичната клетка, тъкан, орган или организъм. По  този  начин, докато  данните  от  генната  експресия на иРНК и протеомните  анализи не  разказват цялата история за  това, което  може  да  се  случи  в клетката, метаболитното профилиране може да  даде мигновена  снимка на физиологията  на  дадена  клетка.

Геномика- наука, която изследва  пълният  геном  на  организма

Митогеномика-  наука, която изследва митохондриалните  гени

Микробиомика- изследване  на  микробиома  в  целият организъм

Нутригеномика-  наука, която изследва връзката  храна- гени, как  храната  влияе  върху  генната  и епигенна  експресия.

Интерактомика- наука,  която изучава  взаимодействията  протеин- протеин , протеин- лиганд,  протеин- ДНК и др. вътреклетъчни  взаимодействия.

Едно  от  предизвикателствата  на  системната  биология и  функционалната  геномика е да се  интегрира протеомна, транскриптомна и метаболомна информация, за да се  даде  пълна  картина за  физиологията  на живите организми на клетъчно и  субклетъчно ниво.

Настъпил е този  момент  на интеграция на  натрупаните  знания във всяка една област на молекулярната  биология, биохимия, генетика, физиология, микробиология, клинична лаборатория и клинична  медицина.

Може  много  още  да  се  пише  по  този  въпрос за  големите възможности  и ползи на  MALDI- TOF  MS,  но  трябва  обезателно да  кажем, че това е  не  само нова  възможност за  ранна  диагноза и анализ, но  това е  ново  знание в медицината, ново  разбиране за  болестите  на клетъчно и суб клетъчно  ниво,  ново  мислене  и  анализиране  на  получените  база  данни, а  така  също  и нов  подход  за  превенцията  на много  социално- значими заболявания:  метаболитни, дегенеративни, генетични , злокачествени и други.

Накрая  правя  следната  уговорка за  това, че аз  не  съм  лабораторен  лекар и моля да  бъда  извинена за някои  неточности  в  изложението  си, но  като  ендокринолог, който  работи  с  хормонална  диагностика, където  мерните  единици  са  нанограми и  пикограми, не  може да  не  оценя  високо  този  уникален  метод, където има  недостижима  точност  и абсолютна  специфичност  по  отношение  на  диагностичната  оценка.

При  направената  справка  се  оказа, че  тази  уникална  нова  технология  MALDI- TOF  MS, може  да  бъде  въведена и в България, благодарение на  проекта на  проф. Д. Свинаров - началник на Клинична  лаборатория и клинична фармакология към УМБАЛ "Александровска".

Използвам  голямата  аудитория на  Кредоуеб да изкажа  моята  подкрепа  за  този  проект, тъй като  смятам,  че  той е от  голямо значение  за  всички нас!

Д-р  Д.  Атанасова  Мутафчиева - ендокринолог , гр . Стара  Загора, МЦ   HBO₂.