Имунохистохимичните методики се базират на антигенните качества на тъканните протеини, които се разкриват чрез свързването им със съответни антитела. Антиген/антителната реакция се извършва на мястото на точната локализация на търсения антиген, а чрез допълнително оцветяване с хромоген тя става достъпна за наблюдение със светлинния микроскоп.

Имунохистохимията /ИХХ/ е наука за разработване на имунни методики  на  тъканно ниво с цел  откриване на вещества с антигенни свойства  в тях. Това става чрез осъществяване на  реакция антиген/антитяло  при специална обработка на тъканите. В диагностичната практика на патолога имунохистохимичният метод е незаменимо  допълнително изследване към хистологичното,  понеже доказва,  уточнява и обективизира различни  компоненти на тъканта, без чието демонстриране  е невъзможно да се изпълнят  изискванията към модерната  морфологична диагностика.

Имунохистохимичните  методики се разработиха и навлязоха широко в биопсичната практика в 80-те години на миналия век. Но те непрекъснато се разширяват, за да бъдат адекватни  на задълбочаването на нашите знания за молекулярно-биологичните основи на патологичните процеси.

Същност на имунохистохимичните методики 

ИХХ  методики се базират на антигенните  качества на тъканните протеини,които се разкриват чрез свързването им със съответни антитела.  Антиген/антителната реакция се извършва на мястото на точната локализация на търсения антиген, а чрез допълнително оцветяване с хромоген тя става достъпна за наблюдение със светлинния микроскоп. Към всеки от разнообразните протеини в организма  може да се образуват антитела  в серума  на опитни животни /обикновено  мишки, плъхове или  овци/, които се пречистват за целите на  ИХХ изследване. ИХХ методики са многоетапни, с последователно инкубиране  на фиксираната или свежо замразена тъкан с първичното антитяло, което се свързва както с  тъканния антиген така и  с ензимен комплекс- пероксидаза/антипероксидаза или авидин/биотин.

Накрая този  комплекс се третира с  цветно вещество . При наличие на търсения антиген в тъканта се получава цветен продукт, който е показателен за положителна реакция. Обратно, реакцията е негативна при липса на  оцветяване,т.е на  антиген.  Патологът отчита интензивност на реакцията /обикновено в три степени/, разпространение / в проценти/ и  локализация на продукта- ядро, цитоплазма, мембрана, съдове и др.Всяка стъпка от  методиката, от фиксацията  до получаването на цветната реакция има голямо значение за качеството и достоверността на имунохистохимичната реакция. Сега най-голямо приложение има изследването на тъканни срези от парафинови блокчета.

В имунохистохимията се използват  разнообразни  моноклонални /реагиращи само с един антиген/ и поликлонални /реагиращи с много сходни антигени/  антитела. Те са  способни да се свържат и открият разнообразни  тъканно специфични или  туморно-специфични антигени, протеини , свързани с определени клетъчни структури, напр. филаменти, микротубули, интермедиерни филаменти, адхезионни  и сигнални молекули, растежни фактори и рецептори за тях,  генни или генно-модифицирани белтъци , абнормни продукти в тъканите /напр. амилоид/, ензими, хормони , вируси и  др.

Приложението на ИХХ  в патологията е много широко  особено  в туморната патология, където има диагностично, прогностично и предиктивно  значение. Използва  се  също за установяване на етиологични фактори, напр. папилома-вирус инфекции, антигени на хепатитните вируси, хеликобактер и др. Голяма е ролята им при диагнозата  на гломерулните заболявания на бъбреците,  за откриване на антитела и имунни комплекси при съединително-тъканните  заболявания с имунни нарушения , при редица дегенеративни и възпалителни  заболявания на нервната и мускулната система. 

ПРИЛОЖЕНИЕ НА  ИХХ В ДИАГНОСТИКАТА НА ТУМОРИТЕ

Преди всичко ИХХ методите  ни помагат да определим хистогенезата на тумора, следователно тяхната точна диагноза.Това важи предимно за  недиференцираните тумори, които  имат сходна хистологична картина, но се различават по своя произход. Затруднението в диференциалната диагноза на тези тумори най-добре е синтезирано в мисълта на  Клемперер, че  „Изоморфията не е  изогения„ т.е. еднаквата форма не означава еднакъв произход. Точно с ИХХ метод  стана възможно уточняването на хистогенезата и точна диференциална диагноза на  редица тумори.Тук се отнасят:

·  Дребноклетъчните солидни  недиференцирани на хистологично ниво  тумори, каквито са недиференцирания карцином  (small-cell carcinoma)на бронха,карцином на Меркел, невроендокринни карциноми, лимфоми, дребноклетъчни меланоми и др.

·  Всички дребноклетъчни солидни ембрионални тумори в детска и юношеска възраст- саркоми на Юинг/периферни ПНЕТ, медулобластоми, централни ПНЕТ, ембрионални рабдомиосаркоми, невробластоми и др.

·  Всички вретеновидноклетъчни и плеоморфни саркоми  - фибросаркоми, фиброхистио-цитни тумори, липосаркоми, рабдомиосаркоми, лейомисаркоми, малигнените тумори от обвивките на нервите, остеосаркоми,  гастроинтестинални стромални тумори, малигнени меланоми и др.

Определянето на хистогенезата на тумора има незаменимо значение при изследване на метастатични тумори  с неясно първично огнище, напр. при метастази в мозъка, които в около 30% от случаите  се проявяват с неврологична симптоматика  преди да има клинична мани-фестация  от първичния тумор, при метастази в лимфни възли,  в черния дроб, яйчници, кости и др., при карциноза на плевра и перитонеум. В тези случаи патолозите  използваме панел /комплекс/ от имунохистохимични методики, от чиито резултати, съпоставени с хистологичната картина  определяме точно първичния тумор или  насочваме към него.

Трябва да отбележим,че понякога възникват затруднения за  разграничаване на  метастатичен  от първичен тумор в определен орган,  напр. при карциноми на белия дроб, на плеврата,  на яйчника, на черния дроб, щитовидната жлеза и др.В тези случаи също прибягваме към подходящи ИХХ панели с включени в тях и тъканно- специфични антитела ,напр. хепатоцитен антиген, мезотелно-клетъчен антиген, тиреоглобулин и др .

ИХХ дава възможност да се прецизира субтипа на туморите, както е при:

·  Имунофенотипизация на  лимфомите, дали са В-клетъчни, Т-клетъчни, нито В нито Т, анапластични и др.

·  Определяне на  точните компоненти на  смесените тумори /карциносаркоми, адено-карциноиди , комбинирани герминативноклетъчни тумори и  др./

·  Определяне на  диференциацията в някои тумори, което има прогнозно и диагностичнозначение /напр.невроендокринна диференциация в някои панкреатични карциноми или  в дребноклетъчни карциноми, невробластна диференциация в медулобластоми и др./

ИХХ  се използва в  диференциалната  диагноза на нискодиференцираните тумори, напр. за разграничаване на нискодиференциран уротелен карцином от нискодиференциран ацинарен карцином на простатната жлеза, на  нискодиференциран дуктален от лобуларен карцином на млечната жлеза и много други.

ИХХ характеризира растежния потенциал на туморите чрез определяне на пролиферативния индекс /ПИ/, т.е броя на клетките, които са в активен растеж на 100 туморни клетки. Това става чрез доказване на експресията на MIB 1 или К-67 в ядрата на туморните клетки.  Ki-67 е нехистонен ДНК свързващ протеин, който участва във всички фази на клетъчния цикъл  без G0. ПИ  се включва в многофакторния прогнозен фактор при много тумори  за уточняване на степента на злокачественост  /напр.при невроендокринни тумори, при глиални тумори / и на степента на риск за рецидиви /при ГИСТ/.

ИХХ Онкопротеините са продукти на онкогените, чиято роля в етапите  на канцерогенезата  - от инициация, през  промоция  до прогресия на туморите е доказана. Чрез имунохистохимичното им разкриване  ние можем по-лесно и достъпно в сравнение с генетичните методи да установим молекулярно-генетичните промени в туморите, защото онкопротеините  са  видимата част, айсберга на мутиралите онкогени. Експресията на онкопротеините позволява не само да проследим  процеса на онкогенеза още от етапа на преканцероза, но също да определим  прогнозата и предвидим ефекта от приложеното лечение. С други думи ИХХ доказване на онкопротеините  има определено прогнозно и предиктивно значение. Това е много съществена роля на ИХХ , защото дава възможност да се прецени  молекулярно-биологичния статус  и  предпише съответно лечение на  всеки отделен индивид .  позволи определянето  на  онкопротеини в туморите.

  ИМУНОХИСТОХИМИЧНОТО ИЗСЛЕДВАНЕ КАТО ПРОГНОЗЕН ФАКТОР

Определянето на прогнозата, т.е.  еволюцията на тумораq се измерва най-често с преживяемостта на болните. Тя е многофакторен  процес и включва редица  показатели като пол, възраст, големина,  локализация , хистологичен вид и  стадий на тумора , степен на неговата малигненост и др. Резултатите от ИХХ изследване на някои тъканни маркери-онкопротеини, ензими, растежни фактори, сигнални молекули и  др. често имат определено  прогнозно значение като част от многофакторния анализ или са независими прогнозни индикатори. Все повече молекули, участващи в онкогенезата на различни тумори  се изследват с ИХХ и се включват в стандартите за оценяване на туморната прогноза.Тук ще посоча само някои тъканни маркери, чиято положителна експресия има неблагоприятно прогнозно значение при много малигнени тумори:

·  Свръхекспресията на bcl-2 / инхибитор на апоптозата / 

·  TTF-1 /ядрен транскрипционен фактор/,

·  HER-2/мембранен  протеин свързан с рецептора на епидермалния растежен фактор/

·  VEGF /васкуларен растежен фактор/,

·  p53 /ключов фактор за регулация на клетъчната  пролиферация, супресия и апоптоза/.Мутациите на този ген водят до загуба на супресията, инхиби-ране на апоптозата, т.е. осигуряват безсмъртност на туморните клетки.

·  fasciin /актин фибрилен протеин/. Прогнозира прогресия на туморите с метастазиране поради повишаване на мотилитета на туморните клетки.

·  COX-2 /ензимq отговорен  за простагландиновата синтеза/. Счита се, че той „разпалва” туморния растеж.

·  Ki-67 за установяване на ПИ. При увеличение на ПИ над 20 прогнозата е неблагоприятна при всички малигнени тумори.

  РОЛЯ НА ИХХ КАТО ПРЕДИКТИВЕН ФАКТОР ПРИ ТАРГЕТНАТА ТЕРАПИЯ

Таргетната терапия е противотуморна терапия, при която се използват биологични вещества, наречени таргетни, които избирателно атакуват жизнено важни за туморите процеси и така предизвикват тяхната смърт или ограничение на растежа им. Таргетите се залавят за определени места в тумора -рецептори, които представляват мишени /прицели / на действието им. Определянето на тези податливи за въздействие молекули става посредством имунохистохимични или генетични методи, а лекарствата, които разумно подбират мястото  на действието си, осигуряват подходящо  лечение на  изследвания болен, т.е. то  е персонализирано. Таргетите са специфични вещества, които действат избирателно само на туморните клетки  след доказване на предварително определен предиктивен фактор и имат минимален страничен ефект.

Понастоящем широко приложение имат два типа таргетни лекарства: а /Моноклонални антитела, които се прицелват в два вида рецептори на повърхността на туморните клетки- рецептори за EGFи за VEGF. б/ Малки молекули .Типичен пример са тирозин-киназните инхибитори, които блокират мутиралия  ензим тирозинкиназа,който се активира чрез епидер-малния растежен фактор. Те се прилагат при хронична миелоидна левкемия и при гастро-интестиналните стромални тумори /ГИСТ/. В процес на изследване са и много други таргетни лекарства, но с противоречиви резултати: въвеждане на гени,напр. на дивия тип на р53, заглушаване на гени чрез инхибиране на транслацията на информационна РНК, деметилиращи агенти, инхибитори на хистон деацетилазата и на протеазоми. 

Типичен пример за избор на таргетни лекарства е ракът на гърдата. Въз основа на изследването на хормонални рецептори за естроген и прогестерон се прилага хормонално лечение , а позитивна реакция за  рецептора за подвид на епидермалния растежен фактор /ЕGF/- HER-2 (c-erb) индицира  прилагане на херцептин.При карцинома на белите дробове предиктивна роля има изследването на EGF рецептор, чиято свръхекспресия  посочва добър отговор при прилагане на тирозин-киназните инхибитори erlotinib и gefinitib. Ниската  експресия на ERCC1 /  ендонуклеаза на нуклеотиден поправящ комплекс/ e предиктивен за по-добър отговор при лечение на недребноклетъчните карциноми  с carboplatine/gemcitabine. /. Експресия на bcl-2 посочва резистентност към химио- и лъчелечение при пациенти с недребноклетъчен белодробен карцином.

Особено показателен за ролята на ИХХ изследване е фактът, че в диагностичните стандарти  на много тумори  са включени ИХХ тестове, чието значение е доказано в практиката. С други думи ИХХ са елемент на медицината на доказателствата. ИХХ стандарти за естрогенови и прогесте-ронови рецептори и за HER-2 са приети  за  туморите на млечната жлеза;  изследване за  хромогранин А, синаптофизин и Ki-67 за невроендокринни тумори; изследване на  CD117 за ГИСТ. Разбира се , трябва да кажем, че все пак ИХХ изследва протеините, които са продукти на гена, а не самите генни дефекти или мутации. Не винаги сигналът е достатъчно силен за да се докаже имунохистохимично.

С това се обяснява разминаването на резултати получени при ИХХ и генетични методики, които са безспорно по-точни. Но ИХХ със своята достъпност, бързина на изследване и икономически изгодна цена има определени предимства и дава  ценна информация за комплекс от показатели, съществени за диагнозата, еволюцията, прогнозата и за избора на прицелна терапия. Предиктивната  роля на ИХХ метод , необходим за избор  на персонализирано лечение, предопределя перспективното разширение на приложението му в онкопатологичната практика.

Без ИХХ изследване с или без допълнително генетично изследване не е възможно да се осъществи персоналното лечение на пациентите, което е задача на модерната онкология.Тази функция на ИХХ непрекъснато се разширява във връзка със задълбочаване на знанията ни за молекулярно-генетичната база на туморите  и мощното развитие на фармакотерапиятаq разработваща все по-нови прицелни препарати , атакуващи молекули-генератори на онкогенезата.